年1月4日，发表在《NanoLetters》上的一篇文章“NanomedicineDirectsNeuronalDifferentiationofNeuralStemCellsviaSilencingLongNoncodingRNAforStrokeTherapy”。在此，中山大学帅心涛团队报道用纳米材料诱导神经干细胞定向分化为神经细胞，用于治疗中风。
背景介绍
中风仍然是世界上死亡和残疾的主要原因。中风期间缺乏血液流动会导致复杂的病理生理反应，从而导致神经细胞丧失。迄今为止，唯一有效的治疗方法是使用溶栓药物或血管内取栓术对闭塞的动脉进行早期再通以挽救濒死的神经元。然而，这些治疗的时间窗口被限制在从症状出现的4.5-6小时。外源性神经干细胞(NSCs)的移植不仅因其延长的治疗窗口，而且其独特的修复效果，即直接替换神经细胞来修复受损的神经回路，正成为一种有吸引力的治疗方式。然而，大多数移植的NSCs通常分化为星形胶质细胞，只有一小部分NSCs分化为神经元。这种有限的神经元分化极大地限制了NSCs的治疗效果。因此，迫切需要制定合适的策略来指导NSCs移植后的神经元分化。这将提高NSC的治疗效果，有利于NSC治疗脑卒中的临床转化。
众所周知，NSCs从多能干细胞向神经元的谱系分化进程受到各种细胞程序的严格控制，这些内在程序可以通过沉默某些信使RNA（mRNA）或长非编码RNA（lncRNA）来表观遗传地调控。PnkylncRNA可以有效抑制NSCs的神经元分化。Pnky与聚嘧啶束结合蛋白1（PTBP1）相互作用以调节一系列与细胞表型有关的转录本，因此PnkylncRNA能够作为指导神经干细胞神经元分化的新手段。
小干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASO）可以有效地敲除核和细胞质lncRNA。但是，siRNA和ASO在体内不稳定，难以被细胞内在化。为了克服这个问题，帅心涛团队开发一种MRI可见的纳米载体，该载体同时将siRNA/ASO和SPIO编码传递到NSC中，以沉默PnkylncRNA，同时允许在体内进行MRI跟踪移植的NSC。
研究内容以阳离子两亲性聚合物PALC作为载体，通过乳化法对Fe3O4进行包载。并通过正负电荷吸附作用，将siRNA/ASO结合到纳米颗粒表面。如图a所示，当N/P达到7时，siRNA/ASO能够很好的结合到颗粒表面。如图b,c所示，在接上siRNA/ASO之后，颗粒形壳核结构，并且具有比单纯Fe3O4更好的T2成像效果。
在最佳转染条件下，普鲁士蓝染色显示，转染细胞的胞质溶胶中存在大量蓝染颗粒（图a）。TEM分析证实了溶酶体内部暗电子致密铁颗粒的细胞吸收（图b）。对AAS的进一步定量分析证实，铁的平均含量为每个细胞3.12pg，因此可以通过MRI轻松跟踪已移植的NSC。荧光显微镜在转染后的NSC中观察到大量绿色荧光（FAM），表明siRNA/ASO的细胞摄取显着（图c）。流式细胞仪定量分析表明，SPIO-PALC介导的siRNA/ASO的转染效率高达95.88％（图d）。这些结果表明，这种纳米载体可以在体外有效地将siRNA/ASO和SPIO编码传递到NSC中。此外，溶酶体染色后的共聚焦显微镜显示出siRNA/ASO的溶酶体分布（图e）。因此，通过足够的细胞摄取，基于PALC的纳米药物最终实现了干细胞的同时成像和遗传修饰。
为了评估纳米药物对Pnky的抑制效率，通过将SPIO-PALC与以预定N/P比为7/1的靶向Pnky的siRNA和ASO的混合物复合来制备Pnky-SPIO-PALC。实时定量PCR（qPCR）显示，转染后24小时PnkylncRNA的表达降低了63.2％（图a），表明由Pnky-SPIO-PALC介导的PnkylncRNA的有效敲低。作为阴性对照，SCR-SPIO-PALC转染不影响NSC的PnkylncRNA水平。为了评估纳米药物转染的安全性，用Pnky-SPIO-PALC和SCR-SPIO-PALC转染NSC后，通过AnnexinV/PI双重染色、CCK8检测，神经球检测和免疫荧光染色检测考察NSC的细胞凋亡率，生存力，干性和多分化潜能。显然，用Pnky-SPIO-PALC或SCR-SPIO-PALC转染不会影响细胞凋亡（P0.1，图3b），增殖能力（P0.1，图3c），巢蛋白阳性神经球形成或多系分化能力（图3d），表明纳米药物对NSCs的生物学特性没有有害影响。
为了评估PnkylncRNA敲低对体外神经元分化的影响，在用Pnky-SPIO-PALC转染后诱导NSCs分化。免疫荧光染色显示，通过Pnky-SPIO-PALC敲除PnkylncRNA可以显着增强体外NSC的神经元分化（图4a）。进一步的定量分析表明，Pnky敲除后与NSC分化的神经元增加到30.43±5.57％，明显高于未经处理的NSC对照的5.98±2.02％和SCR-SPIO-PALC转染的NSC的6.70±2.12％（P0.05）。体内实验设计如图4b所示。将Pnky-SPIO-PALC和SCR-SPIO-PALC转染的表达绿色荧光蛋白的NSC（GFP-NSC）移植到梗死的中心。然后，通过组织学分析评估了PnkylncRNA基因敲低对体内神经元分化的影响。结果显示，用Pnky-SPIO-PALC处理的GFP-NSC存活到移植后4周。βIII-微管蛋白的免疫组织荧光染色显示，在移植后2周，从Pnky-SPIO-PALC治疗的NSC分化出的神经元百分比增加了约5.5倍（18.42±3.43％vs2.89±0.78％，P0.05）和移植后4周的4倍。
为了确定NSC的分布和迁移，在小鼠缺血性中风模型中，将经Pnky-SPIO-PALC转染的GFP-NSC脑内注射到梗死的震中。然后进行MRI以监测移植细胞的分布和迁移。在MRI上，可以通过体内MRI实时跟踪用Pnky-SPIO-PALC处理的移植细胞和用SCR-SPIO-PALC处理的细胞，并在T2*加权图像上清楚地将其检测为强低信号（图5a）和T2加权图像（图5b）。用Pnky-SPIO-PALC处理的NSC在移植后4周仍保持低血压状态，并随着时间的推移逐渐从梗塞震中迁移至梗塞皮层表面。用SCR-SPIO-PALC转染的NSC观察到类似的信号变化模式。此外，Pnky-SPIO-PALC和SCR-SPIO-PALC处理的NSC表现出相似的时空迁移模式（图5a，b），表明Pnky敲低对迁移能力没有不利影响。基于脑梗死体积和神经功能分析，最终测试了神经干细胞的体内治疗效果。在T2W图像上测量梗塞体积，其中梗塞表现为具有高强度信号的区域（图5b）。经Pnky-SPIO-PALC转染的NSC，SCR-SPIO-PALC转染的NSC或磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理的小鼠的梗塞体积均随时间逐渐减少（图5b，c）。用Pnky-SPIO-PALC转染的NSC和SCR-SPIO-PALC转染的NSC处理的小鼠的梗死体积低于用PBS处理的小鼠的梗塞体积（P0.05，图5b,c）。此外，在移植后1周，经Pnky-SPIO-PALC转染的NSCs治疗的小鼠的梗塞体积低于经SCR-SPIO-PALC转染的NSCs治疗的小鼠的梗塞体积（P0.05），这表明经Pnky治疗的小鼠-SPIO-PALC转染的NSCs比经SCR-SPIO-PALC转染的NSCs具有更好的结构恢复。改良的神经系统严重程度评分（mNSS）测试用于评估小鼠的神经功能恢复。PBS处理的小鼠的mNSS评分高于Pnky-SPIO-PALC转染的NSC或SCR-SPIO-PALC转染的NSC处理的小鼠。此外，在移植后1周，经Pnky-SPIO-PALC转染的NSCs治疗的小鼠的mNSS评分低于经SCR-SPIO-PALC转染的NSCs治疗的小鼠的mNSS评分（P0.05），表明从移植后的功能恢复更好用Pnky-SPIO-PALC转染的NSC处理的小鼠中的缺血性中风（图5d）。mNSS评估的功能恢复模式与MRI观察到的结构恢复模式一致。这些结果表明，通过Pnky-SPIO-PALC进行Pnky抑制可以显着增强中风的治疗效果。
总结
siRNA/ASO的这种MRI可见性纳米药物的细胞内递送可通过PnkylncRNA下调在体外和体内促进NSC的神经元分化，同时，可以通过体内MRI跟踪PnkylncRNA下调的NSC。因此，NSCs增强的神经元分化增加了NSCs在卒中中的治疗作用。该多功能纳米药物可用于指导干细胞分化，并在移植后体内追踪干细胞，这突显了其作为调节干细胞命运的有前途平台的巨大潜力，从而为开发基于干细胞治疗中风和其他神经系统疾病的疗法奠定了基础。
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